IEF (Isoelektrische Fokussierung)

Die IEF wird hauptsächlich zur Bestimmung der pI eingesetzt, kann aber aufgrund der besonderen Selektivität auch generell für anspruchsvolle Trennungen wie z.B. für Isoformen von Antikörpern verwendet werden.
Im Vergleich zu den anderen Trenntechniken gibt es noch deutlich mehr Ansatzpunkte für Optimierungen, wie z.B. die Art und Konzentration der Ampholytlösung, Konzentration von  Katholyt und Anolyt sowie die Kapillardimensionen und Kapillarbeschichtung und die Art der Mobilisierung.

IEF einer Peptid-Marker-Mischung, ohne Filter

  • Trenntechnik: cIEF
  • Ampholyt: 3-10
  • Kapillare: µSil, 50 µm ID, 32,5 cm gesamt
  • Trennung: 30 kV
  • Mobilisierung: chemisch nach 5 min mit 350 mM Essigsäure
  • Detektion: direkte UV, 275 nm, ohne Filter
  • Katholyt: NaOH
  • Anolyt: Phosphorsäure
  • Beschreibung: Die Standardlösung enthält neben den Peptid-Marken auch die Ampholytlösung mit Gel und Harnstoff. Mit Hilfe der Standardmarker ist die Kalibrierung möglich.
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IEF Peptidstandard mit Kalibrierung

Download: IEF-Peptidmarker

cIEF eines monoklonalen Antikörpers mAK, Einfluss des Ampholyten

  • Trenntechnik: cIEF
  • Ampholyt: 3-10
  • Kapillare: µSil, 50 µm ID, 32,5 cm gesamt
  • Trennung: 30 kV
  • Mobilisierung: chemisch nach 5 min mit 350 mM Essigsäure
  • Detektion: direkte UV, 275 nm, ohne Filter
  • Katholyt: NaOH
  • Anolyt: Phosphorsäure
  • Beschreibung: Der PDF zeigt den Einfluss des Ampholyten auf die Trennung. Mit dem “Breitband”-Ampholyt 3-10 wird bereits eine gute Trennung der Isoformen erhalten. Durch die Einschränkung auf den pI-Bereich von 5-8 wird die Auflösung noch einmal drastisch verbessert. Die Probelösung wurde jeweils zusammen mit den Peptid-Marken, der jeweiligen Ampholytlösung mit Gel und mit Harnstoff angesetzt. Es ist eine genaue pI-Bestimmung der getrennten Isoformen des mAK möglich.
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IEF eines monoklonalen Antikörpers – Vergleich mit verschiedenen Ampholyten

Download: IEF-Ampholyte

cIEF einer Peptidmischung mit IEF-Filter

  • Trenntechnik: cIEF
  • Ampholyt: 3-10
  • Kapillare: µSil-FC, 50 µm ID, 32,5 cm gesamt
  • Trennung: 30 kV
  • Mobilisierung: chemisch nach 6 min mit 350 mM Essigsäure
  • Detektion: direkte UV, 280 nm, mit IEF Filter (Agilent G7100-68750)
  • Katholyt: NaOH
  • Anolyt: Phosphorsäure
  • Beschreibung: Während in den oben gezeigten Abbildungen ohne Filter gearbeitet wurde, ist im hier vorliegenden Beispiel deutlich die Verbesserung von Rauschen und Peakschärfe durch den Einbau des Filters erkennbar. Der Filter kann problemlos per Magnetclip und ohne weiteres Werkzeug vor dem DAD eingesetzt werden. Außerdem werden im PDF der typische Stromverlauf während einer cIEF-Trennung und die Kalibrierung gezeigt.
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cIEF einer Peptidmischung mit Filter

Download: IEF-Peptidmarker-mit-filter

cIEF eines monoklonalen Antikörpers IgG1 mit IEF-Filter

  • Trenntechnik: cIEF
  • Ampholyt: 3-10
  • Kapillare: µSil-FC, 50 µm ID, 32,5 cm gesamt
  • Trennung: 30 kV
  • Mobilisierung: chemisch nach 6 min mit 350 mM Essigsäure
  • Detektion: direkte UV, 280 nm, mit IEF Filter (Agilent G7100-68750)
  • Katholyt: NaOH
  • Anolyt: Phosphorsäure
  • Beschreibung: Die Isoformen des monoklonalen Antikörpers des Typs IgG1 können mit den gewählten Bedingungen deutlich getrennt werden und so deren pI bestimmt werden. Im PDF werden die Trennung sowie die für die pI-Berechnung erhaltene Wertetabelle und Kalibrierfunktion gezeigt.
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cIEF eines monoklonalen Antikörpers des Typs IgG1 mit Filter

Download: IEF-mAb-mit-Filter